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1. Contexte général
Le laboratoire de microscopie ionique a été défini à sa création plus comme un centre pilote national dédié à l'évaluation des dernières évolutions technologiques de l'imagerie par spectrométrie de masse dans le domaine exclusif de la biologie, que comme une plateforme technologique classique.
Développée initialement à l'université d'Orsay (Castaing and Slodzian 1962), l'imagerie par spectrométrie de masse d'ions secondaires est basée sur l'émission de particules secondaires, à partir des quelques premières couches d'atomes (1-2 nm) de la surface d'un échantillon solide, sous l'effet du bombardement par un faisceau d'ions primaires très énergétiques. Sous l'impact, les liaisons chimiques sont rompues et les atomes ou des combinaisons d'atomes sont libérés, soit sous forme neutre, soit sous forme chargée (ions).
Ces ions peuvent être collectés et focalisés sous forme d'un faisceau secondaire jusqu'à l'entrée d'un spectromètre de masse où les ions vont alors être triés en fonction de leur rapport m/z (masse/charge). L'ensemble du système est maintenu sous ultra-vide (10-8-10-10 Torr). Le principal domaine d’applications de cette technique réside jusqu’à présent dans la microanalyse d'échantillons minéraux (géologie, métallurgie, science des semi-conducteurs,...).
Le Nanosims 50, qui constitue la dernière génération de microsonde ionique (Slodzian et al. 1992; Hillion et al. 1993), possède des atouts qui permettent d'envisager des applications biologiques jusque-là inaccessibles. Comme les précédents, ce nouveau microscope est constitué d’une source d’ions primaires, d’un spectromètre de masse et d’un système de détection mais il présente les caractéristiques nécessaires à l’examen d’échantillons biologiques, à savoir :
haute résolution latérale (≤50nm en césium et ≤150 nm en oxygène),
détection parallèle de cinq images ioniques distinctes provenant d'un même microvolume d'analyse et permettant une superposition parfaite des images et une mesure précise des rapports isotopiques,
excellente transmission des ions secondaires même à haut pouvoir séparateur en masse (60% à M/∆M = 5000),
possibilité d’observation optique de l’échantillon dans la chambre d’ionisation pour localiser les zones d’intérêt,
compensation des charges pour les échantillons isolants (en mode "ions secondaires négatifs").
Les projets scientifiques, sur la base desquels les soutiens financiers ont été obtenus, concernent essentiellement la cancérologie fondamentale à travers trois grands types d’applications :
la pharmacologie antitumorale,
l'étude cytogénétique de cellules cancéreuses,
la médecine nucléaire et la radiotoxicologie.
Outre les applications évoquées ci-dessus, le caractère de "centre pilote" du laboratoire nous impose de rester ouvert à la communauté scientifique sur la base de programmes sélectionnés par un groupe d'experts. Ce Comité, présidé par le professeur Michel Thellier, comprend des représentants de tous les partenaires ayant participé au financement de l'équipement.
Par ailleurs, la préparation des échantillons est un aspect important de la méthode du fait de la complexité et de l’aspect dynamique de la matière biologique. La recherche expérimentale dans ce domaine demeure une de nos priorités en poursuivant notamment des travaux sur l'influence des méthodes de préparation sur la diffusion et/ou la perte des petites molécules organiques.
Chaque étape du procédé doit être optimisée en fonction du type d'échantillon et de la finalité de l'expérience afin de préserver la distribution initiale des ions diffusibles et des petites molécules solubles.
Dans ce but, en collaboration avec C. Bordat et M. Lieberherr (INRA, Jouy-en-Josas), nous avons entrepris des études et adapté différentes techniques de cryo-préparation (cryo-fixation par projection ou par haute pression, cryo-substitution ou cryo-lyophilisation, coupe après inclusion ou cryo-section) aux exigences particulières de la microanalyse notamment dans le cas d'espèces très diffusibles (Bordat et al. 2004). Cette étude nous a amenés à équiper le laboratoire d’une des rares plateformes françaises offrant l'ensemble des techniques de cryo-préparation des échantillons.
Enfin, il faut rappeler que la recherche fondamentale sur les mécanismes d'émission des ions secondaires demeure essentielle, surtout en ce qui concerne les espèces polyatomiques qui présentent un intérêt tout particulier avec les échantillons biologiques. Cet aspect est, et devra, bien évidemment être abordé dans le cadre de l’activité de la plateforme.
La microscopie SIMS demande une haute qualification en physique et ne peut en aucun cas être en libre service. L’ingénieur de recherche, qui était en CDD sur un poste Curie, vient récemment d’être recruté sur un poste INSERM pour assurer le fonctionnement et la maintenance de la microsonde et permettre ainsi d'optimiser l'utilisation de cet appareil.
L’activité scientifique de la plateforme est en lien direct avec celle de l’équipe d’imagerie cellulaire (S. Marco), mais sa mission en tant que centre "pilote" impose une ouverture à l’ensemble des questions biologiques qui peuvent être abordées par les techniques de microanalyse. Le laboratoire de microscopie ionique développe ainsi, en collaboration avec diverses équipes, des projets propres regroupés en deux thèmes : "imagerie et caractérisation de nano-structures" et "médecine nucléaire"
2. Imagerie et Caractérisation de nano-structures
2.1. Analyse et caractérisation de la biominéralisation.
En collaboration avec le Dr H. Vali du Centre de Microscopie Electronique de l'Université Mc Gill de Montréal, nous poursuivons une étude des processus de minéralisation et en particulier de la précipitation de l'hydroxyapatite (HA) dans les cellules et les tissus animaux en utilisant notamment une combinaison des techniques d'imagerie et d'analyse par microscopie électronique à transmission (MET) et microscopie ionique. Les objectifs de cette recherche sont i) d'explorer la véritable nature des phases intra- et extracellulaire de précipités de phosphate de calcium, ii) d'étudier le(s) mécanisme(s) de la minéralisation iii) d'identifier les protéines et lipides impliqués dans la minéralisation et iv) d'étudier la cinétique et le processus d'internalisation des nano cristaux d'HA dans les cellules.
La microscopie ionique apparaît essentielle pour atteindre ces objectifs dans la mesure où cette technique permet la détection et la localisation d'ions inorganiques (ie Ca, P, S) associés à la fois aux molécules organiques (protéines, lipides) et aux composés solides inorganiques (matériaux amorphes ou cristallins) à l'intérieur de la structure cellulaire. Des expériences récentes ont permis de réaliser ces analyses ioniques sur des zones préalablement sélectionnées par TEM sur le même échantillon . Cette imagerie corrélative permet de bénéficier à la fois de la très haute résolution latérale de la microscopie électronique et des capacités analytiques de la microscopie ionique. En comparant des tissus calcifiés et non-calcifiés, nous cherchons à déterminer le mode d'interaction entre ces protéoglycanes et les phases minérales observées dans les régions calcifiés des cellules. Ces investigations peuvent être étendues à toute une série de calcifications pathologiques dont le mécanisme de formation reste inconnu. Les études de calcification in vitro, dans divers types cellulaires, ont montré que la précipitation de HA est associée avec des phospho et des protéolipides.
Différents autres projets de caractérisation de micro- et nanostructures ont été abordés de façon complémentaire par les techniques de microscopies électroniques et ionique.
2.2. Corrélation entre la cartographie chimique 3D et la microscopie SIMS.
Dans le cadre de d’un projet coordonné par Sergio Marco au sein du programme GEOMEX, nous avons abordé l’analyse chimique d’inclusions granulaires bactériennes. Ces inclusions, composées de poly-phosphates de fer, probablement enrobés par d'autres composants contenant du soufre, peuvent être analysées sur la même coupe par cartographie chimique 3D et par SIMS (figure 1). La taille de ces inclusions, proche de 100nm, permettra d’évaluer les limites de détection des deux techniques pour différents éléments, notamment le phosphore et le soufre. La mise en place méthodologique de cette étude nécessitera le développement de méthodes d’analyse corrélative d’images et de préparation spécifique d’échantillon.
2,3. Analyse de microagglomérats intraencéphaliques lors du vieillissement cérébral normal ou pathologique.
Au cours de la vie, le fer s’accumule dans des régions bien précises du cerveau et ses concentrations augmentent avec l'âge mais aussi lors de certaines maladies neuro-dégénératives (maladies d'Alzheimer, de Parkinson, de Huntington …). Le fer ferreux, non détoxifié par la ferritine/hémosidérine, accumulé dans les régions cérébrales impliquées dans certaines maladies neurodégénératives, pourrait être à l'origine de radicaux libres initiateurs du stress oxydatif.
Ce travail, entrepris par Carmen Quintana lors d’un séjour sabbatique dans notre laboratoire, (en collaboration avec Marc Dhenain) est centré sur l’étude au niveau subcellulaire des variations de concentration fer/ferritine/hémosidérine, de la forme chimique du fer intracellulaire et de son degré d'oxydation en fonction de l’âge sur un modèle animal, le microcèbe murin (Microcebus murinus). Cette étude a été étendue à des échantillons de cerveau humain provenant de patients décédés de maladies neurodégénératives (MA et PSP) (Quintana et al.2006).
Figure 1 : Mise en place de la corrélation d’images entre le microscope ionique (SIMS) et électronique (TEM). Des images de bactéries contenant des granules de polyphosphate de fer sont acquises au microscope électronique à transmission (TEM). Ces granules apparaîssent comme des objets denses aux électrons, donc noirs dans l’image. Les approches mises en place dans l’équipe permettent d’obtenir des images de la même région du même échantillon en microscopie ionique (SIMS). Ces images nous informent de la composition chimique des objets. La corrélation entre les images TEM et SIMS se fait en utilisant les données correspondant à la distribution carbone-azote à différents niveaux de profondeur dans l’échantillon (SIMS 7, 8 et 9). Ces images sont enregistrées simultanément à d’autres contenant l’information sur la présence d’autres éléments chimiques, dans ce cas oxygène, phosphore et soufre. Un couleur peut être assignée à chacun de ces éléments (rouge = O, vert = P et bleue = S) pour les combiner dans une seule image qui nous permet d’identifier la présence simultanée des trois éléments (blanc) ou l'abondance relative de l'un d’entre eux (bleue dans le cas du S). Ceci peut se faire avec les images acquises à différentes profondeurs en microscopie ionique (7-, 8- et 9-RGB pour SIMS-7, -8 et -9 respectivement). La combinaison de ces images avec les données de TEM permet de localiser la position des granules et de voir comment le granule evolue du blanc au bleu. Dans le cas présent, le granule 2 change dans le sens opposé, ce qu’indique la présence de S distribué de façon irrégulière le long du granule composé majoritairement de polyphosphate de fer. Cette approche peut être maintenant appliquée à la combinaison de données entre le TEM et le SIMS pour suivre des processus régulateurs de signaux tels que ceux qui interviennent dans la synchronisation du battement des cils de la paramécie ou d'autres cellules cilliées.
Les techniques employées pour cette étude sont :
L'IRM qui, par des mesures quantitatives de temps de relaxation T2, nous permet d'évaluer de façon non destructive la localisation histologique des régions les plus riches en Fe dans différentes zones du cerveau.
L'imagerie par spectrométrie de masse d'ions secondaires (SIMS) qui, avec la microsonde NanoSIMS 50, permet une résolution latérale de quelques dizaines de nm, donnant ainsi accès à l'analyse ultra-structurale au niveau cellulaire.
La microscopie electronique à transmission de haute résolution (HRTEM), et les spectroscopies de perte d’énergie des électrons (EELS) et de R-X (EPMA) qui permettent une analyse plus détaillée au niveau cellulaire et ultrastructural, notamment en ce qui concerne le degré d'oxydation du fer.
3. Médecine nucléaire et radiotoxicologie
Une des principales caractéristiques de la microscopie ionique réside dans sa capacité unique à analyser les isotopes. Cette caractéristique peut avantageusement être utilisée dans les domaines de la médecine nucléaire et de la radiotoxicologie. En effet, l'utilisation d'isotopes stables permet de mesurer avec précision et en toute sécurité la localisation des radioéléments mis en œuvre, ce qui donne accès à la fois aux mécanismes impliqués dans cette localisation et aux éléments nécessaires à l'évaluation de la microdosimétrie de l'exposition. Dans ce contexte, nous avons abordé plusieurs sujets liés à ces thématiques. Il s'agit, outre du ciblage du mélanome évoqué au chapitre II, d'un projet portant sur la cartographie cinétique et énergétique des radioisotopes de l’iode au sein du follicule thyroïdien et d'un autre relatif au développement de nouveaux radiopharmaceutiques pour le diagnostic de l’ischémie myocardique et du diabète de type II.
3.1. Cartographie cinétique et énergétique des radioisotopes de l’iode au sein du follicule thyroïdien : conséquences sur la radiotoxicologie différentielle des iodes à vie courte.
[En collaboration avec le Laboratoire de Biophysique de la Faculté de Médecine de Paris VII (Dir Nicole COLAS-LINHART), ce projet est subventionné par le Département de Radioprotection de l'EDF.]
L'accident de Tchernobyl, survenu dans des régions de carence en iode, a entraîné une augmentation du nombre de cancers de la thyroïde chez l'enfant alors que les études dosimétriques, basée sur une répartition homogène de l’iode 131 dans la thyroïde, n'avaient prévu qu'une faible
augmentation de ceux-ci.
Figure 2 : Images de follicules thyroïdiens de rat nouveau-né après administration de 129I. Les images sont obtenues en utilisant une source Césium (Cs+). Les éléments analysés sont P-(m=31), 127I -(m=127) ) et 129I-(m=129). L'utilisation de couleurs spécifiques pour chaque type d'ion permet par superposition des différentes images de co-localiser les ions observés. Ainsi, la distribution physiologique de l'127I peut être observée en bleu, tandis que l'129I (en rouge) donne des informations sur l'absorption des isotopes de l'iode à très courte durée de vie lors d'une contamination. Champ : 50 µm x 50 µm, inclusion dans du Spurr, épaisseur des coupes 0.4 µm, - (collaboration avec IRSN/Fontenay-aux-Roses et le Laboratoire de Biophysique dela Faculté de Médecine de l' Université Paris VII).
L’objectif de cette étude est d'étudier les conséquences de l’hétérogénéité de distribution de l’iode sur la répartition microscopique de la dose. Les échantillons thyroïdiens sont analysés par NanoSIMS (Fig 2) afin d'étudier la distribution des isotopes de l'iode, le 127 correspondant à la répartition physiologique et le 129 donnant des informations sur la distribution des isotopes à courte duré de vie dans le cas d'une contamination.
3.2. Développement de nouveaux radio pharmaceutiques pour le diagnostic de l’ischémie myocardique et du diabète de type II.
[Collaboration avec D.Fagret, Equipe INSERM E340, Service de médecine nucléaire du CHU de Grenoble].
99mTcN-NOET est un nouveau traceur, en cours d’évaluation clinique, pour détecter l’ischémie myocardique. Son utilisation en clinique nécessite de connaître ses mécanismes de fixation cellulaire pour pouvoir interpréter les "images" obtenues chez l'homme.
La microscopie ionique est la seule technique qui permette d'envisager de résoudre ce problème, grâce à sa résolution spatiale. TcN-NOET est-il sur la membrane (fixation sur les canaux calciques) ou entre-t-il dans la cellule selon les mouvements de calcium?
Le diabète de type II, non insulino-dépendant (DNID) est une maladie dont la prévalence augmente en France et dans les pays développé. Un nouveau radiopharmaceutique, le 6-Déoxy-6-Iodo-D-glucose (6-DIG) a été validé comme marqueur du transport du glucose capable de mettre en évidence un déficit de ce transport in vivo et de dépister le stade prédiabétique. Comme pour TcN-NOET, la question posée est de savoir si le 6-DIG marque les transporteurs membranaires ou bien le transport du glucose de part et d'autre de la membrane ? Par ailleurs, le 6-DIG présente un comportement biologique différent dans le cerveau par rapport aux autres organes. Dans le cerveau, la biodistribution in vivo montre une certaine accumulation du 6-DIG. Des études cellulaires in vitro, sur cultures neuronales ou astrocytaires sont en cours pour tenter de comprendre les mécanismes de fixation du traceur sur ces deux types cellulaires. Mais seule la microscopie ionique permet d'envisager de situer le lieu de fixation du 6-DIG dans le cerveau après injection in vivo.
En résumé, dans les trois situations exposées ci-dessus, les moyens actuels d'expérimentation biologique permettent d'envisager, par voie indirecte, les mécanismes de fixation cellulaire de TcN-NOET et du 6-DIG. Mais seule la microscopie ionique, grâce à sa haute résolution spatiale, permettra de trancher entre les différentes hypothèses avancées.
En conclusion, la définition du laboratoire comme centre "pilote" pour le développement des applications biologiques de l'imagerie par spectrométrie de masse nécessite une large ouverture de la plateforme à l'ensemble des problématiques des Sciences de la Vie. Ainsi, bien que l'ensemble du groupe soit totalement partie prenante dans l'équipe d’imagerie cellulaire, un certain nombre de thématiques apparaissent sans lien direct avec les axes de recherche de l’unité. Ceci justifie pleinement un "statut" un peu particulier au sein de cette structure dans laquelle elle est cependant bien intégrée.
